Numer telefonu : +86 13989889852
WhatsApp : +8613989889852
June 15, 2020
Diagnostyka oparta na cfDNA może spowodować, że biopsja tkanki stanie się przestarzała
Costly and invasive tissue biopsies to detect allograft rejection after transplantation have numerous limitations. Kosztowne i inwazyjne biopsje tkanek w celu wykrycia odrzucenia przeszczepu po przeszczepie mają wiele ograniczeń. Assays based on cell-free DNA (cfDNA)—circulating fragments of DNA released from cells, tissues, and organs as they undergo natural cell death—have been intensively studied recently and could ultimately improve our ability to detect rejection, implement earlier changes in management, and even enhance the long-term survival of transplanted organs. Testy oparte na bezkomórkowym DNA (cfDNA) - krążące fragmenty DNA uwalniane z komórek, tkanek i narządów w wyniku naturalnej śmierci komórkowej - zostały ostatnio intensywnie zbadane i mogą ostatecznie poprawić naszą zdolność do wykrywania odrzucenia, wdrożenia wcześniejszych zmian w zarządzaniu , a nawet poprawić długoterminowe przeżycie przeszczepionych narządów.
CfDNA assays that circumvent the need for whole-genome sequencing (WGS) and the need for a priori knowledge of donor and/or recipient genotypes have powerful logistical advantages and are currently under clinical scrutiny. Testy CfDNA, które omijają potrzebę sekwencjonowania całego genomu (WGS) i potrzebę a priori wiedzy o genotypach dawcy i / lub biorcy, mają ogromne zalety logistyczne i są obecnie badane klinicznie. In addition, improving knowledge of the organ-specific kinetics of donor-derived cfDNA (dd-cfDNA) following transplantation has also helped optimize these assays. Ponadto poprawa znajomości specyficznej dla narządu kinetyki cfDNA pochodzącego od dawcy (dd-cfDNA) po przeszczepie również pomogła zoptymalizować te testy. Laboratories also have introduced alternative methods for quantifying dd-cfDNA, such as digital droplet polymerase chain reaction (PCR) and organ-specific DNA methylation patterns. Laboratoria wprowadziły również alternatywne metody oznaczania ilościowego dd-cfDNA, takie jak cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej (PCR) i specyficzne dla narządów wzorce metylacji DNA. As such, the field of minimally invasive diagnostics based upon cfDNA is increasingly promising, one day potentially replacing traditional tissue biopsies. Jako taka, dziedzina małoinwazyjnej diagnostyki opartej na cfDNA jest coraz bardziej obiecująca, pewnego dnia potencjalnie zastępując tradycyjne biopsje tkanek.
ROLA CFDNA W ODRZUCENIU NARZĄDÓW
Rejection, referring to injury of a donated organ caused by the recipient's immune system, can cause allograft dysfunction and even patient death. Odrzucenie, odnoszące się do uszkodzenia narządu dawcy spowodowanego przez układ odpornościowy biorcy, może powodować dysfunkcję przeszczepu, a nawet śmierć pacjenta. T-cell mediated acute cellular rejection (ACR) occurs most often within the first 6 months post-transplant (1). Ostre odrzucenie komórkowe za pośrednictwem komórek T (ACR) występuje najczęściej w ciągu pierwszych 6 miesięcy po przeszczepie (1). ACR involves accumulation of CD4+ and CD8+ T-cells in the interstitial space of the allograft as the recipient's immune system recognizes antigens on the donated organ as foreign. ACR obejmuje akumulację limfocytów T CD4 + i CD8 + w przestrzeni śródmiąższowej przeszczepu, ponieważ układ odpornościowy biorcy rozpoznaje antygeny na oddanym organie jako obce. These T-cells initiate an immune cascade that ultimately leads to programmed cell death (apoptosis) of the targeted cells. Te komórki T inicjują kaskadę odpornościową, która ostatecznie prowadzi do zaprogramowanej śmierci komórki (apoptozy) docelowych komórek. As these cells die, genomic DNA is cleaved and fragments of dd-cfDNA, measuring approximately 140 base pairs (bp) in length, are released to join the pool of recipient cfDNA in the blood and ultimately excreted in the urine (2). Gdy komórki te umierają, genomowy DNA jest odcinany, a fragmenty dd-cfDNA o długości około 140 par zasad (pz) są uwalniane, aby dołączyć do puli biorcy cfDNA we krwi i ostatecznie wydalane z moczem (2).
Circulating cfDNA has recently been leveraged as a diagnostic tool to replace invasive biopsies in other areas of medicine, including analyzing fetal DNA fragments within the maternal circulation to identify genetic abnormalities in utero and sequencing circulating DNA released from tumor cells to identify cancer-related mutations. Krążący cfDNA został ostatnio wykorzystany jako narzędzie diagnostyczne do zastąpienia inwazyjnych biopsji w innych obszarach medycyny, w tym analizy fragmentów DNA płodu w krążeniu matki w celu zidentyfikowania nieprawidłowości genetycznych w macicy i sekwencjonowania krążącego DNA uwolnionego z komórek nowotworowych w celu zidentyfikowania mutacji związanych z rakiem. In both these cases as well as in transplantation, high-throughput sequencing that identifies and quantifies DNA sequence differences distinguishes between the two different populations of cfDNA derived from distinct sources (2). W obu tych przypadkach, a także w transplantacji, wysokoprzepustowe sekwencjonowanie, które identyfikuje i kwantyfikuje różnice w sekwencji DNA, rozróżnia dwie różne populacje cfDNA pochodzącego z różnych źródeł (2). Three characteristics of cfDNA make it an excellent noninvasive candidate biomarker to detect rejection after solid organ transplantation: It can be obtained from a simple blood draw, its concentration accurately measured, and its nucleotide sequence easily identified. Trzy cechy cfDNA sprawiają, że jest to doskonały nieinwazyjny biomarker kandydujący do wykrywania odrzucenia po przeszczepie narządu stałego: Można go uzyskać na podstawie zwykłego pobrania krwi, dokładnie zmierzyć jego stężenie i łatwo zidentyfikować sekwencję nukleotydową. Using cfDNA as a biomarker for ACR is also advantageous since it is derived from the injured cells of the donated organ and therefore should represent a direct measure of cell death occurring in the allograft. Zastosowanie cfDNA jako biomarkera dla ACR jest również korzystne, ponieważ pochodzi z uszkodzonych komórek dawcy narządu i dlatego powinien reprezentować bezpośredni pomiar śmierci komórki występującej w przeszczepie. Furthermore, cfDNA maintains all of the genetic features of the original genomic DNA, allowing the genetic material released from the donated organ to be differentiated from the cfDNA derived from cells of the recipient that are undergoing natural apoptosis (3). Co więcej, cfDNA zachowuje wszystkie cechy genetyczne oryginalnego genomowego DNA, pozwalając na odróżnienie materiału genetycznego uwolnionego od dawcy narządu od cfDNA pochodzącego z komórek biorcy poddanych naturalnej apoptozie (3).
Frequent and accurate monitoring of allograft health is essential for transplant recipients' long-term survival. Częste i dokładne monitorowanie stanu zdrowia przeszczepu jest niezbędne dla długoterminowego przeżycia biorców przeszczepu. For heart transplantation (HT), endomyocardial biopsy (EMB) is the current gold standard for detecting ACR (4). W przypadku przeszczepu serca (HT) biopsja endomyokardialna (EMB) jest obecnie złotym standardem wykrywania ACR (4). However, EMBs are costly with significant limitations, many of which are common to all organ biopsies (5-7). Jednak EMB są kosztowne ze znacznymi ograniczeniami, z których wiele jest wspólnych dla wszystkich biopsji narządów (5-7). Moreover, the invasive nature of EMBs puts HT patients at risk for complications (6,8,9). Ponadto inwazyjny charakter EMB naraża pacjentów z HT na powikłania (6,8,9).
Unfortunately, currently available noninvasive methods including echocardiography or magnetic resonance imaging (MRI) lack sufficient specificity and sensitivity to reliably detect rejection (10-13). Niestety obecnie dostępne nieinwazyjne metody, w tym echokardiografia lub rezonans magnetyczny (MRI), nie są wystarczająco specyficzne i czułe, aby wiarygodnie wykryć odrzucenie (10-13). Blood-based biomarkers, such as cfDNA, represent a promising alternative that could be readily implemented into clinical practice (14-17). Biomarkery krwi, takie jak cfDNA, stanowią obiecującą alternatywę, którą można łatwo wdrożyć w praktyce klinicznej (14-17).
KINETYKA CFDNA PODCZAS WYPADKU I ODRZUCENIA
Since cfDNA originates from the naturally occurring process of apoptosis, all individuals have detectable levels of cfDNA in their blood (18). Ponieważ cfDNA pochodzi z naturalnie zachodzącego procesu apoptozy, wszystkie osoby mają wykrywalne poziomy cfDNA we krwi (18). For healthy individuals, the majority of circulating cfDNA comes from hematopoietic cells that have undergone natural death related to cellular turnover. U zdrowych osób większość krążącego cfDNA pochodzi z komórek krwiotwórczych, które uległy naturalnej śmierci związanej z obrotem komórkowym. Levels of cfDNA fluctuate for multiple reasons including infection, surgery, trauma, or even exhaustive exercise (2,19). Poziom cfDNA zmienia się z wielu powodów, w tym z infekcji, operacji, urazu, a nawet wyczerpujących ćwiczeń (2,19). Therefore, developing a cfDNA-based assay to detect rejection requires assessing the expected kinetics of dd-cfDNA release into the recipient's circulation post-transplant. Dlatego opracowanie testu opartego na cfDNA w celu wykrycia odrzucenia wymaga oceny oczekiwanej kinetyki uwalniania dd-cfDNA do krążenia biorcy po przeszczepie. This consideration is especially important since the release of dd-cfDNA over time post-transplant is organ-specific (20-22). Ta uwaga jest szczególnie ważna, ponieważ uwalnianie dd-cfDNA w czasie po przeszczepie jest specyficzne dla narządu (20-22).
For example, at 1 day post-HT the average level of dd-cfDNA is 3.8 ± 2.3% (20). Na przykład 1 dzień po HT średni poziom dd-cfDNA wynosi 3,8 ± 2,3% (20). However, by 7 days the level of dd-cfDNA has declined rapidly and remains consistently low (<1%). Jednak do 7 dni poziom dd-cfDNA gwałtownie spadł i pozostaje niezmiennie niski (<1%). During an episode of acute rejection in the heart, the level of dd-cfDNA was found to increase to 4%–5% from a baseline of about 0.06% observed during quiescence. Podczas epizodu ostrego odrzucenia w sercu stwierdzono, że poziom dd-cfDNA wzrasta do 4–5% w stosunku do wartości wyjściowej wynoszącej około 0,06% obserwowanej podczas spoczynku. The kinetics of dd-cfDNA observed in the circulation of HT recipients was similar to that observed after renal transplantation (22). Kinetyka dd-cfDNA obserwowana w krążeniu biorców HT była podobna do obserwowanej po przeszczepie nerki (22).
In contrast, recipients of bilateral lung transplants were found to have an average dd-cfDNA fraction of 26 ± 14% on the first postoperative day. Przeciwnie, stwierdzono, że biorcy dwustronnych przeszczepów płuc mieli średnią frakcję dd-cfDNA 26 ± 14% w pierwszym dniu po operacji. Furthermore, the reduction in dd-cfDNA was characterized by levels of dd-cfDNA that declined rapidly within the first week but then slowed and generally remained at 1%–3% (21). Ponadto zmniejszenie dd-cfDNA charakteryzowało się poziomem dd-cfDNA, który gwałtownie spadł w ciągu pierwszego tygodnia, ale następnie zwolnił i ogólnie pozostawał na poziomie 1–3% (21). However, similar to heart and kidney transplants during an episode of acute rejection, the level of dd-cfDNA increased significantly, climbing to an average of 14%–15%. Jednak podobnie do przeszczepów serca i nerek podczas epizodu ostrego odrzucenia poziom dd-cfDNA znacznie wzrósł, osiągając średnio 14–15%.
Differences in tissue mass and rates of cellular turnover account for this variability in the levels of dd-cfDNA released early post-transplant and during quiescence. Różnice w masie tkanek i szybkościach obrotu komórkowego odpowiadają za tę zmienność poziomów dd-cfDNA uwalnianego wcześnie po przeszczepie i podczas spoczynku. For example, differences in circulating dd-cfDNA levels in quiescent bilateral and single-lung transplants can be explained by the difference in cellular turnover, being 107 vs. 58 cells/second, respectively (21). Na przykład różnice w krążących poziomach dd-cfDNA w cichych przeszczepach obustronnych i pojedynczych płucach można wyjaśnić różnicą w obrotach komórkowych, wynoszącą odpowiednio 107 vs. 58 komórek / sekundę (21). By contrast, in a quiescent transplanted heart, the cellular turnover rate is only 8 cells/second (21-23). Natomiast w spoczynkowym przeszczepionym sercu wskaźnik obrotu komórkowego wynosi tylko 8 komórek / sekundę (21–23). Thus, an understanding of the expected levels of dd-cfDNA associated with a given solid organ is essential to facilitate development of organ-specific assays that detect rejection. Zatem zrozumienie oczekiwanych poziomów dd-cfDNA związanych z danym organem stałym jest niezbędne do ułatwienia opracowania testów specyficznych dla narządów, które wykrywają odrzucenie. Once the kinetics of cfDNA release for a particular organ are understood, several methods exist for quantifying the relative amount of dd-cfDNA. Po zrozumieniu kinetyki uwalniania cfDNA dla konkretnego narządu istnieje kilka metod oceny ilościowej względnej ilości dd-cfDNA.
STRATEGIES TO DISTINGUISH RECIPIENT- VS. STRATEGIE DO WYRÓŻNIANIA ODBIORCY - VS. DONOR-DERIVED CFDNA CFDNA POCHODZĄCA Z DONORA
Niedopasowanie płci dawcy-biorcy
For organ transplants in which the donor is male and the recipient is female, laboratories can leverage this sex mismatch to calculate dd-cfDNA levels from within the recipient's total cfDNA pool (17). W przypadku przeszczepów narządów, w których dawcą jest mężczyzna, a biorcą jest kobieta, laboratoria mogą wykorzystać to niedopasowanie płci do obliczenia poziomów dd-cfDNA z całkowitej puli cfDNA biorcy (17). Researchers first demonstrated the feasibility of this approach in urine samples taken from female renal transplant recipients who had received a kidney from male donors and when they experienced rejection demonstrated elevated levels of dd-cfDNA in their urine that specifically contained regions found on the Y chromosome (17). Naukowcy po raz pierwszy wykazali wykonalność tego podejścia w próbkach moczu pobranych od kobiet biorców przeszczepu nerki, którzy otrzymali nerkę od dawców płci męskiej, a kiedy doświadczyli odrzucenia, wykazali podwyższony poziom dd-cfDNA w moczu, który konkretnie zawierał regiony znalezione na chromosomie Y ( 17). Although this approach allows for confident diagnosis of rejection in the allograft, sex-mismatch between the donor and recipient is relatively infrequent and not universally applicable. Chociaż takie podejście pozwala na pewną diagnozę odrzucenia w przeszczepie, niedopasowanie płci między dawcą a biorcą jest stosunkowo rzadkie i nie ma uniwersalnego zastosowania.
Różnice w sekwencji DNA dawcy-biorcy
An organ transplant can also be regarded as a genome transplant, as the cells within a transplanted organ contain the genetic information of its donor. Przeszczep narządu można również uznać za przeszczep genomu, ponieważ komórki w przeszczepionym narządzie zawierają informacje genetyczne jego dawcy. As such, the concept of genome transplant dynamics (GTD) relies on the presence of genetic differences between the donor and recipient at a particular locus, which then can be leveraged to identify the origin of the circulating cfDNA (20-24). Jako taka, koncepcja dynamiki przeszczepu genomu (GTD) opiera się na obecności różnic genetycznych między dawcą a biorcą w danym locus, które następnie można wykorzystać do identyfikacji pochodzenia krążącego cfDNA (20–24). Ideally, the recipient would be homozygous for a single base (for example, AA) and at the same locus the donor would be homozygous for a different base (for example, GG). Idealnie, biorca byłby homozygotyczny dla jednej bazy (na przykład AA), a w tym samym miejscu dawca byłby homozygotyczny dla innej bazy (na przykład GG).
Given the genetic heterogeneity between individuals, tens of thousands of potentially informative loci across the genome can be interrogated using high-throughput sequencing to distinguish dd-cfDNA from recipient cfDNA (20,24). Biorąc pod uwagę genetyczną heterogeniczność między osobami, dziesiątki tysięcy potencjalnie pouczających loci w genomie można przesłuchać przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania w celu odróżnienia dd-cfDNA od cfDNA biorcy (20,24). This concept was first illustrated using banked samples from cardiac donors to obtain a priori donor genotypes for each donor-recipient pairing. Ta koncepcja została najpierw zilustrowana przy użyciu zgromadzonych próbek od dawców sercowych w celu uzyskania genotypów dawcy a priori dla każdej pary dawca-biorca. After extracting and sequencing cfDNA from each recipient, the fraction of donor-specific molecules was determined. Po ekstrakcji i sekwencjonowaniu cfDNA od każdego biorcy określono frakcję cząsteczek specyficznych dla dawcy. In samples taken during or immediately preceding a biopsy-proven rejection event, the proportion of donor-specific single nucleotide polymorphisms (SNPs) was found to have increased from <1% to >3%–4% (24). W próbkach pobranych podczas lub bezpośrednio przed zdarzeniem odrzucenia potwierdzonym przez biopsję, odsetek specyficznych dla dawcy polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) wzrósł z <1% do> 3% –4% (24).
This early retrospective study has now been validated prospectively. To wczesne badanie retrospektywne zostało teraz zatwierdzone prospektywnie. Adult and pediatric heart and lung transplant recipients were recruited and genotypes for each donor-recipient pair were obtained through WGS with an average of 53,423 informative SNP markers identified (20). Rekrutowano dorosłych i pediatrycznych biorców serca i płuca, a genotypy dla każdej pary dawca-biorca uzyskano za pomocą WGS ze zidentyfikowanymi średnio 53.423 informacyjnymi markerami SNP (20). Overall, early detection of acute rejection was superior to that of AlloMap, the first Food and Drug Administration-approved non-invasive approach to detecting ACR after HT based on transcriptome analysis (25). Ogólnie rzecz biorąc, wczesne wykrycie ostrego odrzucenia było lepsze niż w przypadku AlloMap, pierwszego nieinwazyjnego podejścia do wykrywania ACR zatwierdzonego przez Food and Drug Administration do HTZ po HT opartego na analizie transkryptomu (25).
Research also has shown that WGS not only provides information about a graft but also a patient's virome and overall state of immunosuppression. Badania wykazały również, że WGS dostarcza nie tylko informacji o przeszczepie, ale także wirusu pacjenta i ogólnego stanu immunosupresji. This represents a potentially great advantage unobtainable by other assays (26-28). Stanowi to potencjalnie wielką zaletę nieosiągalną w innych testach (26–28).
However, WGS faces challenges that could prevent it from being implemented routinely in clinical practice. Jednak WGS stoi przed wyzwaniami, które mogą uniemożliwić jego rutynowe wdrożenie w praktyce klinicznej. For example, while a recipient's genetic information can be easily obtained, this is not always true for a donor. Na przykład, chociaż informacje genetyczne biorcy można łatwo uzyskać, nie zawsze jest to prawdą dla dawcy. Moreover, WGS is costly, labor intensive, and time-consuming. Ponadto WGS jest kosztowny, pracochłonny i czasochłonny.
An alternative method employs a panel of genotyped polymorphic SNPs identified within the pool of extracted cfDNA thereby eliminating the need for a priori knowledge of a donor's specific genotype (29). Alternatywna metoda wykorzystuje panel genotypowanych polimorficznych SNP zidentyfikowanych w puli wyekstrahowanego cfDNA, eliminując w ten sposób potrzebę a priori wiedzy o specyficznym genotypie dawcy (29). Unlike kidney and liver transplants, which often occur between closely related individuals, the donor-recipient pairs for heart and lung transplants typically are not related. W przeciwieństwie do przeszczepów nerek i wątroby, które często występują między blisko spokrewnionymi osobami, pary dawca-biorca dla przeszczepów serca i płuc zazwyczaj nie są powiązane. GTD requires genotyping of both the transplant recipient and donor. GTD wymaga genotypowania zarówno biorcy przeszczepu, jak i dawcy. However, in practice, donor genotype information is often unavailable. Jednak w praktyce informacje o genotypie dawcy są często niedostępne. Here, we address this issue by developing an algorithm that estimates dd-cfDNA levels in the absence of a donor genotype. Tutaj rozwiązujemy ten problem, opracowując algorytm, który szacuje poziomy dd-cfDNA przy braku genotypu dawcy. Our algorithm predicts heart and lung allograft rejection with an accuracy that is similar to conventional GTD. Nasz algorytm przewiduje odrzucenie przeszczepu serca i płuc z dokładnością podobną do konwencjonalnej GTD. We furthermore refined the algorithm to handle closely related recipients and donors, a scenario that is common in bone marrow and kidney transplantation. Ponadto udoskonaliliśmy algorytm, aby obsługiwał blisko spokrewnionych biorców i dawców, co jest scenariuszem powszechnym w transplantacji szpiku kostnego i nerki. We show that it is possible to estimate dd-cfDNA in bone marrow transplant patients who are unrelated or who are siblings of the donors, using a hidden Markov model. Pokazujemy, że możliwe jest oszacowanie dd-cfDNA u pacjentów po przeszczepie szpiku kostnego, którzy nie są ze sobą spokrewnieni lub są rodzeństwem dawców, przy użyciu ukrytego modelu Markowa. Therefore, algorithms have been developed for heart and lung transplants which assume that the donor's genotype occurs at the same frequency as the general population. Dlatego opracowano algorytmy dla przeszczepów serca i płuc, które zakładają, że genotyp dawcy występuje z tą samą częstotliwością, co ogólna populacja. Based on these frequencies and comparison to the known genotype of the recipient, the fraction of dd-cfDNA can be reliably estimated from the total pool of cfDNA isolated from a recipient's plasma sample. Na podstawie tych częstotliwości i porównania ze znanym genotypem biorcy, frakcję dd-cfDNA można wiarygodnie oszacować na podstawie całkowitej puli cfDNA izolowanej z próbki osocza biorcy.
In the case of lung transplantation, this single-genome model, when compared to the methodology using both donor and recipient genotypes, was found to provide comparable fractions of dd-cfDNA. W przypadku przeszczepu płuc stwierdzono, że ten model jednego genomu, w porównaniu z metodologią wykorzystującą zarówno genotyp dawcy, jak i biorcy, zapewnia porównywalne frakcje dd-cfDNA. However, when researchers applied this same algorithm to HT, the estimated levels of dd-cfDNA were not as strongly correlated as in lung transplants. Jednak gdy badacze zastosowali ten sam algorytm do HT, szacowane poziomy dd-cfDNA nie były tak silnie skorelowane jak w przeszczepach płuc. This might be related to the lower absolute amounts of dd-cfDNA present after HT. Może to być związane z niższymi bezwzględnymi ilościami dd-cfDNA obecnymi po HT. This is another example of organ-specific cfDNA kinetics that can influence assay results and must be taken into account (30). Jest to kolejny przykład specyficznej dla narządu kinetyki cfDNA, która może wpływać na wyniki testu i należy ją wziąć pod uwagę (30).
In the case of renal transplantation, prospective studies have been conducted to ascertain the utility of dd-cfDNA levels, identified using known donor-specific SNPs, as a viable marker for rejection. W przypadku przeszczepienia nerki przeprowadzono prospektywne badania w celu ustalenia przydatności poziomów dd-cfDNA, zidentyfikowanych przy użyciu znanych SNP swoistych dla dawcy, jako realnego markera do odrzucenia. In one such study, 384 kidney recipients were recruited from 14 clinical sites to provide blood samples at scheduled intervals and at times of clinically indicated biopsies (31). W jednym z takich badań zrekrutowano 384 biorców nerek z 14 ośrodków klinicznych w celu dostarczenia próbek krwi w zaplanowanych odstępach czasu oraz w czasie klinicznie wskazanych biopsji (31). Overall, the study focused on the correlation between the histology in 107 biopsy specimens from 102 patients and the levels of dd-cfDNA found in matched plasma samples. Podsumowując, badanie koncentrowało się na korelacji między histologią 107 próbek biopsji od 102 pacjentów a poziomem dd-cfDNA w dopasowanych próbkach osocza. More specifically, 27 biopsy samples from 27 patients with active rejection were obtained along with 80 biopsy samples from 75 patients without active rejection. Dokładniej, uzyskano 27 próbek biopsji od 27 pacjentów z aktywnym odrzuceniem oraz 80 próbek biopsji od 75 pacjentów bez aktywnego odrzucenia.
In this study, active rejection included acute antibody-mediated rejection (AMR), chronic AMR, and ACR. W tym badaniu aktywne odrzucenie obejmowało ostre odrzucenie za pośrednictwem przeciwciał (AMR), przewlekłe AMR i ACR. The assay used in this study employed a 1% cutoff for the fraction of dd-cfDNA to indicate the presence or absence of active rejection and was found to have 85% specificity (95% CI, 79%–91%) and 59% sensitivity (95% CI, 44%–74%). Test zastosowany w tym badaniu wykorzystał 1% wartości odcięcia dla frakcji dd-cfDNA, aby wskazać obecność lub brak aktywnego odrzucenia i stwierdzono, że ma 85% swoistości (95% CI, 79% –91%) i 59% czułości (95% CI, 44% –74%). The sensitivity of this assay was greater for discriminating between active and absent AMR, as the use of a cutoff of 1% dd-cfDNA was found to have an 83% specificity (95% CI, 78%–89%) and 81% sensitivity (95% CI, 67%–100%). Czułość tego testu była większa przy rozróżnianiu między aktywnym a nieobecnym AMR, ponieważ stwierdzono, że zastosowanie wartości odcięcia 1% dd-cfDNA ma 83% swoistość (95% CI, 78% –89%) i 81% czułości (95% CI, 67% –100%). Notably, in both cases, the sensitivity declined substantially when the fraction of dd-cfDNA exceeded 3%. W obu przypadkach czułość znacznie spadła, gdy frakcja dd-cfDNA przekroczyła 3%.
To improve specificity and sensitivity of a non-invasive cfDNA-based assay to detect rejection following renal transplantation, investigators also have surveyed the absolute amount of dd-cfDNA (32-33). Aby poprawić swoistość i czułość nieinwazyjnego testu opartego na cfDNA w celu wykrycia odrzucenia po przeszczepie nerki, badacze zbadali również bezwzględną ilość dd-cfDNA (32-33). By interrogating the absolute amount of dd-cfDNA, one can eliminate the artificial changes in the fraction of dd-cfDNA due to increases in total cfDNA levels caused by non-rejection events, such as infection, trauma, or exercise, potentially creating a more accurate assay. Przesłuchując bezwzględną ilość dd-cfDNA, można wyeliminować sztuczne zmiany we frakcji dd-cfDNA z powodu wzrostu całkowitego poziomu cfDNA spowodowanego zdarzeniami braku odrzucenia, takimi jak infekcja, uraz lub ćwiczenia, potencjalnie tworząc więcej dokładny test.
To investigate this possibility, one study employed 32 informative copy number variants (CNVs) based on population frequencies, as opposed to relative proportions of donor and recipient SNPs at given loci (32). Aby zbadać tę możliwość, w jednym badaniu wykorzystano 32 warianty liczby kopii informacyjnych (CNV) w oparciu o częstotliwości populacji, w przeciwieństwie do względnych proporcji dawców i biorców SNP w danych loci (32). All CNVs not present within a recipient's genome but present within the extracted cfDNA were therefore assumed to represent dd-cfDNA. Dlatego przyjęto, że wszystkie CNV nieobecne w genomie biorcy, ale obecne w wyekstrahowanym cfDNA, reprezentują dd-cfDNA.
Interestingly, while the specificity and sensitivity improved overall with the use of absolute dd-cfDNA levels, this assay also had a greater capacity to distinguish between the presence and absence of active AMR, as opposed to cases of active ACR. Co ciekawe, podczas gdy swoistość i czułość poprawiły się ogólnie dzięki zastosowaniu bezwzględnych poziomów dd-cfDNA, test ten miał również większą zdolność do rozróżniania obecności i braku aktywnego AMR, w przeciwieństwie do przypadków aktywnego ACR. In addition, serum creatinine levels were not sufficient in discriminating between active rejection and quiescence, likely because it is more indicative of glomerular function as opposed to kidney tissue damage (31-33). Ponadto poziomy kreatyniny w surowicy nie były wystarczające do rozróżnienia między aktywnym odrzucaniem a spokojem, prawdopodobnie dlatego, że bardziej wskazuje na funkcje kłębuszkowe niż na uszkodzenie tkanki nerkowej (31–33).
Another study explored the absolute levels of dd-cfDNA in kidney transplant recipients related to levels of tacrolimus, an immunosuppressant (33). W innym badaniu zbadano bezwzględne poziomy dd-cfDNA u biorców przeszczepu nerki związane z poziomem takrolimusu, immunosupresyjnego (33). Here, the researchers found that the absolute amount of dd-cfDNA was substantially higher in patients with lower tacrolimus levels (<8 μg/L) in comparison to those with higher drug levels. Tutaj naukowcy odkryli, że bezwzględna ilość dd-cfDNA była znacznie wyższa u pacjentów z niższym poziomem takrolimusu (<8 μg / l) w porównaniu do pacjentów z wyższym poziomem leku. These data suggest that dd-cfDNA levels also have the potential to detect allograft injury resulting from inadequate immunosuppression. Dane te sugerują, że poziomy dd-cfDNA mają również potencjał do wykrywania uszkodzenia przeszczepu allogenicznego wynikającego z nieodpowiedniej immunosupresji.
Laboratories also have proposed alternatives to WGS. Laboratoria zaproponowały również alternatywy dla WGS. Our group explored targeted sequencing of 124 highly polymorphic (minor allele frequency [MAF] >0.4) SNPs using a commercially available panel, next-generation sequencing, and a novel algorithm (34). Nasza grupa badała ukierunkowane sekwencjonowanie 124 wysoce polimorficznych (częstotliwość małych alleli [MAF]> 0,4) SNP przy użyciu dostępnego w handlu panelu, sekwencjonowania nowej generacji i nowatorskiego algorytmu (34). This approach significantly reduced the total amount of sequencing required, decreasing costs and assay time, and enabling rapid analysis. Takie podejście znacznie zmniejszyło całkowitą ilość wymaganego sekwencjonowania, zmniejszając koszty i czas testu oraz umożliwiając szybką analizę. However, since this assay relies upon differences in MAF between individuals, it would not be robust for closely related donor–recipient pairs, such as seen in living-related kidney donation. Ponieważ jednak test ten opiera się na różnicach w MAF między osobami, nie byłby on wiarygodny dla ściśle powiązanych par dawca-biorca, takich jak obserwowane w przypadku dawstwa nerki związanego z życiem. It remains to be validated for detecting moderate or greater rejection events. Pozostaje do zatwierdzenia w celu wykrycia umiarkowanych lub większych zdarzeń odrzucenia.
Laboratories also have explored using polymorphic SNPs to quantify dd-cfDNA combined with the technology of digital droplet PCR (30,35-37). Laboratoria badały również przy użyciu polimorficznych SNP do oceny ilościowej dd-cfDNA w połączeniu z technologią cyfrowej PCR z kroplami (30,35-37). Using 41 highly polymorphic SNPs, stable kidney and HT recipients showed dd-cfDNA fractions of 2%–3% with stable liver transplant recipients having a level of 7% (35). Stosując 41 wysoce polimorficznych SNP, stabilni biorcy nerki i HT wykazali frakcje dd-cfDNA w zakresie 2–3%, a stabilnych biorców przeszczepu wątroby na poziomie 7% (35).
WNIOSKI
The use of a costly and invasive tissue biopsy to detect allograft rejection has significant limitations. Zastosowanie kosztownej i inwazyjnej biopsji tkanki do wykrycia odrzucenia przeszczepu ma znaczne ograniczenia. As such, a minimally invasive assay that can directly and accurately assess the health of the entire transplanted organ represents a holy grail in solid organ transplantation. Jako taki, minimalnie inwazyjny test, który może bezpośrednio i dokładnie ocenić zdrowie całego przeszczepionego narządu, reprezentuje świętego Graala w przeszczepie narządu litego.
The use of cfDNA after transplantation has shown some initial promise, but further study and validation is required to improve our understanding of both the basic biology of cfDNA as well as its behavior post-transplant. Zastosowanie cfDNA po przeszczepie wykazało pewne wstępne obietnice, ale konieczne są dalsze badania i walidacja w celu lepszego zrozumienia zarówno podstawowej biologii cfDNA, jak i jego zachowania po przeszczepie. At this time, it is clear that important organ-specific differences exist, and patterns of cfDNA release may also differ depending on the type of rejection event. W tej chwili jasne jest, że istnieją istotne różnice specyficzne dla narządów, a wzorce uwalniania cfDNA mogą się również różnić w zależności od rodzaju zdarzenia odrzucenia. However, cfDNA represents one of the most promising technologies yet developed to complement or even ultimately replace the tissue biopsy. Jednak cfDNA stanowi jedną z najbardziej obiecujących technologii, jakie dotychczas opracowano w celu uzupełnienia lub nawet ostatecznego zastąpienia biopsji tkanki.
